Zanussi ZMC19M Bedienungsanleitung

Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Studium membránové lokalizace konservovaného hypotetického lipoproteinu bakterie Franci

4.1.11 Použité přístroje a pomůcky ... 38 4.2 Metody a pracovní postupy ...

11 1. Úvod F. tularensis je jemná pleimorfní Gram-negativní intracelulární bakterie vy-volávající zoonotické onemocnění tularemie. F. tularensis

12 2. Teoretická část 2.1 Francisella tularensis 2.1.1 Francisella tularensis – intracelulární patogen Bakterie F.tularensis je Gram-negativn

13 2.1.2 Faktory virulence F. tularensis Jedny z klíčových struktur spojených s virulencí se jeví povrchové proteinové struktury bakterií. Proteiny

14 potentiator, FTT1043); N-koncová část ortologu autotransporterového proteinu Yersinia YapH-N (FTT0918); C-koncová část ortologu autotran

15 riboflavin syntázy (NP_819678) a ABC transportér (ATP binding cassette transporter). Z výše uvedených údajů je patrné, že otázka fak

16 Pro diagnostiku se spíše než kultivace používá aglutinační test nebo ELISA. Tradiční metodou diagnostiky je právě aglutinační test, který však nen

17 tak i polyklonální protilátky proti LPS antigenu. Citlivost tohoto testu je 106 CFU/ml ve fosfátovém pufru a 107 CFU/ml v lidském séru. Imunochro

18 prachu nebo aerosolu. Pravděpodobně nejzávažnější je poslední zmiňovaná forma – plicní. Projevuje se zánětem plic, kašlem, dušností a bolestí na h

19 Gram-negativních bakterií, nebo polysacharidy obsažené v buněčné stěně Gram-pozitivních bakterií. Tyto struktury mohou vedle ochrany proti v

20 bilní komplex II. třídy). Nebezpečí superantigenů spočívá v jejich schopnosti vyvolat autoimunitní onemocnění (Bednář a kol., 1996; Macela a kol.,

21 Bakteriální lipoproteiny jsou u Gram-negativních bakterií lokalizovány ve vnitřní či vnější membráně nebo v periplazmě. To, v jaké části m

22 stoupení jednotlivých aminokyselinových zbytků v „lipobox“ sekvenci. Pokud je na druhém místě kyselina asparagová (CXD), pak bude teoreticky odhad

23 klasického β-barelu či proteiny sekretované jinak než sekreční drahou typu II (Gardy a kol., 2003). Program LipoP je schopný predikovat N-koncovou

24 (http://www.epibio.com/f5_4/f5_4pp.asp) a alkalická fosfatáza (PhoA), která po při-dání vhodného substrátu (např. 5-bromo-4-chloro-3-indolylfo

25 Podle nedávných výzkumů tyto dva lipoproteiny hrají jednu z hlavních a důležitých rolí při vrozené imunitní odpovědi na infekci vyvolanou

26 3. Cíl práce Cíle diplomové práce vycházejí z výsledků a požadavků předcházejícího vý-zkumu. Hlavním cílem bylo, na základě predikčních algoritm

27 4. Experimentální část 4.1 Chemikálie, materiál a přístrojové vybavení 4.1.1 Chemikálie 40 % akrylamid/bis 37,5:1 (akrylamid), Amresco, USA Ag

28 Koncentrát rychloustalovače, Foma Bohemia spol. s r.o., ČR Koncentrát vývojky, Foma Bohemia spol. s r.o., ČR Kyselina boritá (H3BO3), Penta, ČR Ky

29 Destilovanou H2O jsme doplnili do 50 ml, zamíchali a filtrovali přes filtr 0,2 µm Corning. Alikvoty jsme uchovávali při -20 °C. Blokovací roztok:

30 Kanamycin (Kan; 60 mg/ml): kanamycin ………………………… 3 g destilovaná H2O …………………. 30 ml Destilovanou H2O jsme doplnili do 50 ml, zamíchali a filtro

31 MnCl2 …………………………… 55 mM CaCl2 ……………………………. 15 mM KCl …………………………….. 250 mM MnCl2 jsme přidali až po úpravě pH na 6,7 pomocí KOH. Roztok jsme

32 E1 (resuspendace buněk): Tris ……………………... 50 mM EDTA ………………..….. 10 mM pH upravené pomocí HCl na 8,0 E2 (lyze buněk): NaO

33 TBE-rozpouštěcí roztok L2 (promytí, rekonstituce): etanol NaCl EDTA Tris-Cl 4.1.4 Enzymy T4 DNA ligáza a 10x koncentr

34 Pufry pro restrikční endonukleázy: BamHI pufr: Tris-HCl (pH=8,0 při 37 °C) …... 10 mM MgCl2 ……………………………. 5 mM KCl ……………………………. 100

35 Red pufr: Tris-HCl (pH=8,5 při 37 °C) …… 10 mM MgCl2 …………………………... 10 mM KCl ………………………….… 100 mM BSA ……………………………… 0,1 mg/ml

36 Uměle vytvořené oligonukleotidy jsme využili jako primery pro amplifikaci alkalické fosfatázy PhoA, FTT1103 a FTT1103∆-PhoA (Tab. II). Název pr

37 destilovaná H2O …………………………. 3,25 ml SDS (10 %) ……………………………... 50 µl APS (10 %) ……………………………... 50 µl TEMED ………………………………..… 5 µl Dělicí gel pro SDS

38 Bacto Tryptone …………………………... 2 % (w/v) kvasničný extrakt ………………………... 0,5 % (w/v) NaCl ……………………………………. 10 mM KCl ……………………………………… 2,5 mM Sterilizov

39 Centrifuga Sigma 3-18K, Sigma, Německo Digitální váhy EW 150-3M, Kern&Sohn GmbH, Německo Elektroforetická vana s podložkou a těsnícími klíny,

Prohlašuji: Tuto práci jsem vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a infor-mace, které jsem v práci využila, jsou uvedeny v seznam

40 UV transluminátor UVT-20M/W, Herolab, Německo Vertikální elektroforéza SE250, Hoefer, USA Vodní lázeň-termostatovaná BM 302, Nüve, Turecko Zdroj

41 4.2.2 Transformace plazmidové DNA do superkompetentních buněk Na ledu jsme nechali rozehřát suspenzi superkompetentních buněk (BL21 λDE3

42 dělili buňky, které jsme následně resuspendovali ve 4 ml roztoku E1. Postupně jsme přidali roztoky E2 a E3 a inkubovali (RT, vždy po 5 min). Vznik

43 4.2.4.3 Defosforylace 5´-konců lineární plazmidové DNA K 20 µl reakční směsi (4.2.4.2) jsme přidali 1 µl CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphata

44 resp. 105 µl). Restrikční směs jsme důkladně promíchali a nechali štěpit 2 hodiny při 37 °C. Poté jsme restrikční směs obarvili 160 µl (40 µl) bro

45 čisté mikrozkumavky a doprostřed sorpční hmoty jsme napipetovali 50 µl destilova-né vody předehřáté na 70 °C. Kolonku jsme opět centrifugovali

46 procházet napětí 80 V, dokud vzorek neprošel zaostřovacím gelem. Jakmile vzorek doputoval do gelu dělicího, zvýšili jsme napětí na 150 V. Elektrof

47 s křenovou peroxidázou, která umožňuje detekci. Po inkubaci se sekundární protilát-kou jsme membránu promyli v promývacím roztoku, který jsm

48 5. Výsledky a diskuse 5.1 Příprava expresních vektorů Výsledky získané predikčním programem LipoP ukazují, že FTT1103 je membránově lok

49 U všech vytvořených vektorů jsme restrikční analýzou ověřovali správnost zaklonovaných inzertů. Velikosti fragmentů jsou uvedeny v tab. IV

Poděkování: Ráda bych na tomto místě poděkovala Ing. Marcele Šimšové, Ph.D., za vede-ní mé diplomové práce a cenné rady při její

50 Strategie vytvoření vektoru pTZ19R-PhoA je znázorněna na obr. 6. Zdrojem PhoA byl plazmid pSWFII, ze kterého jsme alkalickou fosfatázu vyš

51 Dalším vektorem, který jsme vytvořili, byl pTZ19R-FTT1103-AD (Obr. 7 a 8). Spojení FTT1103 s adaptorem (AD) jsme vytvořili nejprve v plazm

52 o velikosti 1105 bp a pomocí agarózové elektroforézy jej izolovali. Plazmid pTZ19R jsme linearizovali restrikčními endonukleázami SalI a SacI a př

53 B: A: SalI pTZ19R 1) Linearizace pTZ19R SalI 2) Izolace fragmentu 2862 bp 1) Štěpení SalI a XhoI 2) Izolace fragmentu FTT1103-AD o velikosti 109

54 Pro vytvoření vektoru pTZ19R-FTT1103-AD-PhoA jsme využili již připra-vený vektor pET28b-FTT1103-AD z výroby vektoru pTZ19R-FTT1103-AD (Obr

55 Ligace FTT1103-AD-PhoA a pTZ19R štěpeného SalI a SacI Ligace PhoA a pET28b-FTT1103-AD štěpeného XhoI 1) Štěpení SalI a SacI 2) Izolace fragmentu

56 Pro vytvoření vektoru pTZ19R-FTT1103∆-PhoA jsme nejprve chtěli použít stejnou strategii jako u vytváření vektoru pTZ19R-FTT1103-AD-PhoA, avšak tí

57 5.2 Exprese a detekce jednotlivých proteinů v E.coli Expresi jednotlivých proteinů jsme prováděli v bakteriích obsahující námi vy-tvořené vektor

58 FTT1103∆-PhoA (95 kDa). Naproti tomu imunochemická detekce polyklonální pro-tilátkou anti-FTT1103 odhalila možnou kontaminaci bakteriálních

59 170,130 95 72 55 43 34 26 170 130 95 72 55 43

Anotace Nedávno publikované studie ukazují, že proteiny membránového bakteriální-ho komplexu DsbA-DsbB mají přímý vztah k virulenci mikroba (

60 5.3 Využití fosfatázové aktivity pro lokalizaci konservova-ného hypotetického lipoproteinu Bakterie nesoucí vytvořené vektory jsme kultivovali př

61 protein, nebo je lokalizován do periplazmy, či vnější membrány a jeho C-konec s navázanou PhoA směřuje do periplazmy (www.sci.sdsu.edu;

62 6. Závěr 1. Z vektoru pSWFII jsme vyštěpili gen pro PhoA, vnesli jej do plazmidu pTZ19R a restrikční analýzou ověřili jeho zaklonování. 2. N

63 7. Literatura: Bednář, M., Fraňková, V., Schindler,J., Souček, A., Vávra, J.: Lékařská mikrobiolo-gie. Praha: Nakladatelství Marvil, 1996: 255-2

64 Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M.L.: Identification of Secreted Proteins of My-cobacterium tuberculosis by a Bioinformatic Approach. Infec

65 Kamalakkannan, S., Murugan, V., Jagannadham, M.V., Nagaraj, R., Sankaran, K.: Bacterial lipid modification of proteins for novel engeneering appli

66 Prochazkova, K., Osicka, R., Linhartova, I., Halada, P., Sulc, M., Sebo, P.: The Neis-seria meningitis Outer Membrane Lipoprotein FrpD Binds the R

67 Internetové odkazy: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi - predikční program BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=re

Zkratky: 2-DE Dvoudimenzionální elektroforéza A Alanin A,C,G,T,W Nukleotidy - adenin, cytosin, guanin, tymin, adenin nebo tymin ABC ATP binding c

LVS Live Vaccine Strain MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization MHC II Hlavní histokompatibilní komplex II. třídy min minuta PBS Phosph

Obsah 1. Úvod ......................... 11 2. Teoretická část ....